干扰素及拉米夫定抗乙型肝炎病毒的体外实验研究杨永峰 , 谭德明 , 谢玉桃 , 侯周华【摘要】 目的 探讨干扰素及拉米夫定 (3 TC) 的体外抗乙型肝炎病毒作用。 方法 以 Hep G2 2 ,2 ,15 为细胞模型 ,实验共观察 9 d ,于第 3、 6、 9 天收集培养上清进行 HBsAg 定量检测 ;收集细胞提取总 RNA ,行 RT2PCR 及荧光实时定量 PCR 测细胞内乙肝病毒 mRNA 水平。 结果 实验第 3 天及第 6 天 ,对照组和各实验组之间 HBsAg 滴度及病毒 mRNA 水平差异无显着性 ;实验第 9 天 ,干扰素及拉米夫定组 HBsAg 和病毒 mRNA 水平均较对照组明显降低 ,α 2干扰素浓度 500 IU/ ml 时抑制作用达最大 ,3 TC 浓度为 5 μ g/ ml 时抑制作用达最大。 结论 干扰素及拉米夫定均可抑制Hep G2 2 ,2 ,15细胞内乙肝病毒基因的转录和表达 ,提示两种药物都可直接抑制乙肝病毒复制。【关键词】 干扰素类 ; 拉米夫定 ; 肝炎病毒 ,乙型【中图分类号】 R978. 7 ; R373. 21 【文献标识码】 A 【文章编号】 100826013 (2004) 0320209204An in vitro study on the effects of interferon and lamivudine on hepatitis B virus YAN G Yong2feng ,TAN De2ming , XIE Yu2tao , HOU Zhou2hua. Depart ment of Inf ectious Diseases , Xiangya Hospital ,Cent ral South U niversity , Changsha 410008 , China【 Abstract】 Objective To evaluate the in vitro inhibitive activities of interferon2alpha and lamivudineagainst hepatitis B virus. Methods Hep G2 2 ,2 ,15 cell were used as cell model. At 3rd , 6th and 9thday , supernatant was collected for HBsAg quantitative assay , total RNA was isolated for RT2PCR andrealtime2PCR assay. Results No significant difference were found among all groups about HBsAg titerand virus mRNA level at 3rd and 6th day. At 9th day , HBsAg titer and virus mRNA level from inter2feron groups and lamivudine groups were significant lower than those of control. It showed that theycould get maximal inhibition effect on concentration of 500 IU/ ml (interferon) and 5μ g/ ml (lamivu2dine) . Conclusions Interferon and lamivudine can inhabit transcription and expression of HBV gene inHep G2 2. 2. 15 cell. It indicated that interferon and lamivudine can inhibit HBV replication directly.【 Key words】 interferons ; lamivudine ; hepatitis B virus( Chin J Dis Cont rol Prev 2004 ,8 (3) :2092212 ) 乙型病毒性肝炎是我国常见的传染病 ,严重的危害着人们的健康。干扰素 (interferon , IFN) 和拉米夫定 (lamivudine ,3 TC) 是公认的能够抑制乙型肝炎病毒 (hepatitis virus B ,HBV) 复制的药物 ,本研究以 Hep G2 2. 2. 15 细胞为模型 ,对 α 2干扰素和拉米夫定的体外抗病毒作用进行了研究和比较。1 材料和方法1. 1 材料 DMEM 培养基及胎牛血清 ( FBS) 购自GIBCO 公司 ; G2418 购自 Sigma 公司 ; Trizol RNA提取试剂购自 Invitrogen 公司 ;M2MLV 逆转录酶购自 Promega 公司 ; Oligdt (18) 购自上海生工公司 ;HBV S 区引物及荧光探针参照文献合成 1 ,上游引【作者单位】 中南大学湘雅医院传染病学教研室 , 湖南 长沙 410008【作者简介】 杨永峰 (1972 - ) ,男 ,河南林州人 ,博士。主要研究方向 :病毒性肝炎。物序列 5’ CCTCTTCA TCCTGCTGCT3’ ,下游引物序列 5’ AACTGAAA GCCAAACA GG3’ ,目的片断333 bp ; 探 针 序 列 FAM2TCCCA TCCCA T2CA TCCTGGGCTTT2TAMRA ;β 2actin 引物购自北京鼎国生物公司 ,上游引物序列 5’ GTGGGGCGCC2CCA GGCACCA3’ , 下游引物序列 5’ CTTCCT2TAA TGTCACGCACGA TTC3’ ,目的片段 542 bp ;HBsAg 定量检测试剂盒 (化学发光法 ) 购自美国雅培公司 ;干扰素 2α 2b ( IFN2α 2b) 由先灵葆雅公司提供 ;拉米夫定由葛兰素公司提供。1. 2 方法1. 2. 1 Hep G2 2 , 2 , 15 细胞培养 将 Hep G22 ,2 ,15细胞接种至 25 cm2 培养瓶中 , 每瓶加入DMEM 混合培养液 (含 10 % FBS 及 380μ g/ mlG2418) 5 ml ,置 37 ℃ ,5 %CO2恒温培养箱中 ,3～ 4 d传代。1. 2. 2 药物作用 将细胞以 3 × 105/ cm2接种于 12·902·疾病控制杂志 2004 年 6 月第 8 卷第 3 期孔培养板 ,每孔加入含 10 %FBS 的 DMEM 1. 5 ml ,次日移除上述培基 ,每孔加入含 5 %FBS 的 DMEM培基 1 ml ;实验组分别加入不同浓度的 IFN2α 或3 TC ,对照组不加药物。每组设 5 个复孔。每 3 天更换培养基 ,并加入含有相同浓度药物的培养基。每个组别设 3 个复数组 ,分别在第 3、 6、 9 d 收获细胞待测 HBV mRNA ,并收集培养基待测 HBsAg 定量。1. 2. 3 细胞毒性研究 采用 M TT 法。用含 10 %FBS 的 DMEM 配制成单个细胞悬液 ,以 5 × 103/ 孔接种于 96 孔培养板 ,每孔体积 200μ l ,实验组分别加入不同浓度的 IFN2α 或 3 TC ,对照组不含药物 ,每组设 5 个复孔。空白孔不加细胞 ,只加培养基。放至 37 ℃、 5 %CO2恒温培养箱中。每 3 天更换含相同浓度药物的培养基。培养第 9 天 , 每孔加入5 mg/ ml M TT 溶液 20μ l ,继续培养 4 h ,中止培养 ,吸弃孔内培养基后每孔加入 DMSO 150 μ l ,振荡10 min ,在酶标仪上选择 490 nm 波长 ,以空白孔调零 ,测定各孔吸光值。1. 2. 4 HBsAg 定量 按照试剂盒操作说明进行 。1. 2. 5 RT2PCR 用 Trizol 法提取细胞总 RNA ,操作按试剂盒说明进行 ,最后以 DEPC 水 50μ l 溶解总RNA。紫外分光光度仪测浓度。取 RNA 2μ g ,加入 oligdt (18) 0. 5μ g ,70 ℃ 5 min ,立即置冰上 ,然后加入 5 × Buffer 5μ l ,dN TP 12. 5 nmol ,RNA 酶抑制剂 25 IU ,M2MLVRT 200 IU ,加 DEPC 水至总体积25μ l ,42 ℃ 60 min 逆转录 ,逆转录后产物为 cDNA ,取 cDNA 2 μ l ,加入 10 × PCR Buffer 5 μ l , dN TP20 nmol ,HBV 上游及下游引物各 50 pmol ,β 2actin上游及下游引物各 50 pmol , Taq 酶 3 IU ,加双蒸水至总体积 50μ l ,至 PCR 仪上扩增 ,反应条件 :94 ℃5 min , (94 ℃ 30 s ,55 ℃ 30 s ,72 ℃ 1 min) 共 30 个循环 ,72 ℃ 10 min ;阴性对照取对照组总 RNA 2μ l为模板 ;反应完毕取 PCR 产物 6μ l 做琼脂糖凝胶电泳。1. 2. 6 荧光实时定量 PCR ( real2time PCR) 取cDNA 2 μ l , 加入 10 × PCR Buffer 5 μ l , dN TP10 nmol ,HBV2S 上游及下游引物各 50 pmol ,HBV2S探针 50 pmol , Taq 酶 2 IU , 加双蒸水至总体积50μ l ,置于荧光 PCR 仪上 ,以不同浓度 HBV 质粒为标准模板 ,反应条件 :94 ℃ 10 min , (94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min ,55 ℃时收集荧光 ) 40 个循环 ,72 ℃10 min。实验结果由软件自动分析得出。用copies/ ml表示 ,将所得结果取对数做统计学分析。1. 2. 7 统计学分析 结果用 ( x ± s) 表示 ,组间比较用方差分析 ,采用 SPSS11. 0 完成。2 结果2. 1 细胞毒性作用 对照组 A 值 (0. 44 ± 0. 08) ;IFN2α 100 IU/ ml、 500 IU/ ml 及 2 500 IU/ ml 组 A值分别为 (0. 39 ± 0. 12) 、 (0. 44 ± 0. 3) 及 (0. 04 ±0. 07) ;3 TC 1μ g/ ml、 5μ g/ ml 及 25μ g/ ml 组 A 值分别为 (0. 37 ± 0. 05) 、 (0. 37 ± 0. 12)及 (0. 39 ± 0. 09) 。各实验组和对照组比较 ,以及各组之间比较 ,差异均无显着性 ,提示 α 2干扰素及拉米夫定在本实验浓度下 ,对 Hep G2 2. 2. 15 细胞无细胞毒性作用。2. 2 HBsAg 定量 实验第 3 天及第 6 天 ,各实验组和对照组比较 ,以及各组之间比较 , HBsAg 滴度差异无显着性。实验第 9 天时 ,各实验组 HBsAg 滴度和对照组相比 ,差异均有显着性 ,提示本实验所用药物浓度对 Hep G2 2 ,2 ,15 细胞内 HBV 基因表达均有抑制作用 ; IFN 500 IU/ ml 时抑制病毒达最大效应 , 和 100 IU/ ml 组相比差异有显着性 ; 3 TC5μ g/ ml时对病毒抑制达最大效应 ,和 1μ g/ ml 组相比差异有显着性 ; 3 TC 5μ g/ ml组 HBsAg 滴度较IFN 500 IU/ ml 组低 (表 1) 。表 1 拉米夫定和干扰素对培养上清中 HBsAg 滴度的影响Table 1 Effects of lamivudine and interferonalpha on HBsAg titer in supernatantGroup ( n = 5) 3rd day 6th day 9th dayControl 47. 52 ± 4. 72 70. 74 ± 7. 12 80. 42 ± 4. 47IFN 100 IU/ ml 48. 43 ± 5. 19 68. 96 ± 4. 70 72. 01 ± 3. 68 3IFN 500 IU/ ml 48. 25 ± 5. 37 69. 42 ± 5. 11 61. 38 ± 6. 93 3 3 #IFN 2500 IU/ ml 46. 73 ± 3. 49 66. 63 ± 9. 31 59. 49 ± 5. 56 3 33 TC 1μ g/ ml 45. 84 ± 4. 64 68. 80 ± 3. 92 60. 34 ± 7. 77 3 33 TC 5μ g/ ml 48. 82 ± 7. 94 68. 41 ± 4. 03 49. 08 ± 7. 12 3 3 &△3 TC 25μ g/ ml 46. 25 ± 6. 18 65. 71 ± 4. 75 46. 93 ± 5. 49 3 3Note : 3 P nificantly different from control group ; # P IFN 100 IU/ ml group ; & P group ; △ P 2. 3 RT2PCR 图 1 为对照组、 IFN 500 IU/ ml 组及 3 TC 5μ g/ ml 组 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果。由图 1 可见 ,实验第 6 天 ,细胞内 HBV2mRNA 水平无明显降低 ;至实验第 9 天 ,3 TC 5μ g/ ml 组及 IFN500 IU/ ml 组细胞内 HBV2mRNA 水平明显降低。2. 4 Real2time PCR 实验第 3 天及第 6 天 ,各实验组和对照组比较、各实验组间比较 , HBV2mRNA拷贝数差异无显着性。实验第 9 天时 ,各实验组HBV2mRNA 拷贝数和对照组相比 ,差异均有显着性 ,提示本实验所用药物浓度对 Hep G2 2. 2. 15细胞内 HBV 基因的转录均有抑制作用 ; IFN 浓度为500 IU/ ml时抑制已达最大效应 ,和 100 IU/ ml 组相·012· Chin J Dis Cont rol Prev 2004 J une ; 8 (3)比差异有显着性 ;3 TC 浓度为 5μ g/ ml时抑制达最大效应 ,和 1μ g/ ml组相比差异有显着性 ;3 TC 5μ g/ ml组 HBV2mRNA 拷贝数较 IFN 500 IU/ ml 组低 (表2) 。图 1 拉米夫定和干扰素对 HBV2mRNA表达的影响(上图 :实验第 6 天 ;下图 :实验第 9 天 )Figure 1 Effect of lamivudine and interferon alpha onHBV2mRNA expression( Upper : 6th day; Lower : 9th day)M : Marker ;1～ 5 :Control group ;6～ 10 :Lamivudine 5μ g/ mL group ;11～ 15 : Interferon 500 IU/ ml group ; — :Negative ;β :β 2actin ;S : HBV2S表 2 拉米夫定及干扰素对 HepG2 2. 2. 15细胞内 HBV2mRNA拷贝数的影响Table 2 Effect of lamivudine andinterferon on HBV2mRNA levelGroup ( n = 5) 3rd day 6th day 9th dayControl 5. 44 ± 0. 40 7. 65 ± 0. 37 8. 39 ± 0. 51IFN 100 IU/ ml 5. 03 ± 0. 33 7. 50 ± 0. 44 7. 38 ± 0. 38 3IFN 500 IU/ ml 5. 62 ± 0. 44 7. 11 ± 0. 41 6. 57 ± 0. 59 3 #IFN 2500 IU/ ml 4. 87 ± 0. 86 7. 00 ± 0. 70 6. 34 ± 0. 40 33 TC 1μ g/ ml 4. 90 ± 0. 70 7. 11 ± 0. 59 6. 62 ± 0. 46 33 TC 5μ g/ ml 5. 36 ± 0. 35 7. 08 ± 0. 39 5. 07 ± 0. 60 3 &△3 TC 25μ g/ ml 5. 26 ± 0. 56 6. 99 ± 0. 58 5. 29 ± 0. 34 3Note : 3 P cantly different from IFN 100 IU/ ml group ; & P from 3 TC 1μ g/ ml group ; △ P group.3 讨论Hep G2 2 ,2 ,15 细胞由 Hep G2 细胞转染完整的乙肝基因而来 ,可稳定的分泌 HBsAg、 HBeAg ,是乙型肝炎病毒感染的体外模型之一 2 ,已广泛应用于抗乙型肝炎病毒药物的筛选。本研究测定了不同浓度的 IFN2α 及 3 TC 对 Hep G2 2 ,2 ,15 细胞内 HBV基因增殖的影响 ,结果显示 ,两种药物在本实验浓度范围内 ,均有抑制 HBV 增殖作用 ,表现为培养上清中 HBsAg 分泌减少 ,以及细胞内 HBV2mRNA 水平降低 ; IFN2α 浓度为 500 IU/ ml 抗病毒效果达最大 ,继续增加剂量抗病毒效果不再增加 ; 3 TC 浓度为5μ g/ ml时抗病毒效果达最大。和 IFN2α 相比 ,3 TC对 HBV 抑制作用更明显。 3 TC 最大可使 HBV2mRNA 拷贝数由 108 copies/ ml 降至 105 copies/ ml ,下降 3 log ; IFN2α 使 HBV2mRNA 下降 2 log。培养上清中 HBsAg 滴度也有相应降低 ,降低程度和HBV2mRNA 平行。所用药物在实验浓度下对细胞均无毒性作用。拉米夫定体外抗病毒作用已被国内外的研究所证实。 2000 年 Ying 等 3 研究认为 ,拉米夫定对Hep G2 2 ,2 ,15 细胞内的 HBV2DNA 复制有明显的抑制作用 ,有效浓度范围 0. 008μ g/ ml～ 5μ g/ ml ,其中浓度为 5μ g/ ml 时抑制作用最明显。曹鸿鹏等 4 研究也证实拉米夫定在体外具有抑制 HBV2DNA 复制的作用。但干扰素是否具有体外抑制病毒作用尚有争议。 1998 年 Hagelstein 等 5 观察了 IFN2α 、IFN2ω 等的体外抗 HBV 作用 ,认为两者均可明显抑制 Hep G2 2 ,2 ,15 细胞内 HBsAg 的表达 ;然而 Kru2ining 等 6 的研究认为 , IFN2α 浓度为 100 IU/ ml时 ,对 Hep G2 2 ,2 ,15细胞内的 HBV 基因复制抑制作用不明显 ; 国内的研究也表明 , IFN2α 浓度为20 IU/ ml及 100 IU/ ml时 ,不能抑制 Hep G2 2 ,2 ,15细胞内 HBsAg 表达 4 。这可能和所选用干扰素制剂、检测方法的敏感性、细胞融合状态以及药物作用时间长短等因素有关。以往应用 Hep G2 2 ,2 ,15 细胞筛选抗 HBV 药物的实验多采用 Southren 杂交、斑点杂交等方法测定细胞内 HBV2DNA , 但该方法敏感性较低 , 且HBV2DNA 的高低并不能反映 HBsAg、 HBeAg 等的分泌水平。本实验采用 RT2PCR 的方法直接测定病毒 mRNA ,并采用 real2time PCR 方法荧光定量检测 ,提高了敏感性 ,并能直接反应 HBsAg 分泌水平。在 PCR 扩增时以细胞总 RNA 为阴性对照 ,从而排除了 DNA 污染可能。本实验研究结果认为 , IFN2α对 HBV 抑制作用较 3 TC 稍弱 ,但在体内抗病毒过程中 ,IFN2α 除诱导抗病毒蛋白 (2′ ,5′ 2寡腺苷酸合成酶等 ) 表达、直接抑制病毒外 ,还有免疫调节作用 7 ;而 3 TC 主要与 dCTP 竞争结合位点 ,干扰病毒 DNA 的合成 8 ,无免疫调节功能。所以体外实验的结果和体内并不完全相符。实践也证明 ,IFN2α和 3 TC 在临床应用中疗效基本相似 9 。实验结果认为 ,α 2干扰素及拉米夫定均能抑制Hep G2 2 ,2 ,15 细胞内 HBV 基因的转录及表达 ,提示两种药物对乙肝病毒有直接抑制作用。本实验采用 RT2PCR 方法 ,对病毒 mRNA 水平进行荧光定量·112·疾病控制杂志 2004 年 6 月第 8 卷第 3 期检测 ,灵敏的反应病毒的转录、翻译活性 ,可广泛应用于乙肝抗病毒药物的体外筛选及疗效评价。【参考文献】1 He ML , Wu J , Chen Y , et al . 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J Hepatol , 1995 , 22 ( 3) : 2632267. 7 Samuel CE. Antiviral actions of interferons J . Clin MicrobiolRev , 2001 ,14 (4) :7782809. 8 Shaw T , Locarnini SA. Preclinical aspects of lamivudine and fam2ciclovir against hepatitis B virus J . J V iral Hepat , 1999 , 6(2) :892106.9 斯崇文 . 慢性乙型肝炎的抗病毒治疗 J . 现代临床医学 ,2001 ,13 (1) :224.(收稿日期 2003211224)(修回日期 2004203208)(张志华校 )◇经验交流 ◇阿拉套山库克他乌地区首次分离出鼠疫杆菌甫拉提·伊明江 1 , 史建勇 1 , 李东会 1 , 安文严 1 , 陈春霞 1 , 木合亚提 2【文献标识码】 B【中图分类号】 R378. 61【文章编号】 100826013 (2004) 0320212201【关键词】 鼠疫 ; 新疆1 基本情况温泉县位于新疆博尔塔拉蒙古自治州西部 ,东经 79° 53′ - 81° 46′ ,北纬 44° 40′ - 45° 20′ ,北部与西部为阿拉套山区 ,是以农牧民为主的县。本次调查主要基于阿拉套山库克他乌地区发现大面积的自毙灰旱獭 ,以及 2002 年温泉县首次在该地区牧犬血清中检出一份鼠疫 F1 抗体。2003 年 5 月 25 日～ 6 月 28 日由新疆疾病预防控制中心和温泉县防疫站组成联合鼠防调查队 ,对阿拉套山库克他乌进行了鼠疫自然疫源地的调查工作。调查目的主要是证实阿拉套山区是否有鼠疫自【作者单位】 1温泉县卫生防疫站 , 新疆 温泉 8335002温泉县扎勒木特乡卫生院 , 新疆 温泉 833500【作者简介】 甫拉提·伊明江 (1967 - ) ,男 ,维族 ,新疆温泉人 ,主管医师。主要研究方向 :地方病防治。然疫源地存在的可能性。2 调查区地理景观及宿主动物密度调查区 (阿拉套山库克他乌 ) 离温泉县城45 km ,调查区路线全长 17 km ,宽 18 km。调查区平均海拔 1 800～ 4 100 米 ,属于山地草原 ,高山草甸带。调查区内优势动物为灰旱獭 ,分布在 2 000～3 000米 ,次为长尾黄鼠 ,与灰旱獭在同一生境和海拔高度。根据定点观察法 ,旱獭平均密度为 5. 5 只 /公顷。根据路线法 ,旱獭密度为 2. 36 只 / 公顷。3 首次鼠疫菌发现方法及监测结果2003 年 7 月 6 日中午 ,库克他乌牧民报告发现自毙旱獭一份 ,温泉县防疫站立即遣派 2 名专业人员收集材料 ,共采集自毙旱獭脏器 1 份 ,自毙旱獭骨髓 3 份。温泉县鼠防专业人员对自毙旱獭脏器进行了间接血凝反向试验 ,结果为阳性 ,滴度 1∶ 1 024。新疆疾病预防控制中心对送检的 4 份标本按鼠疫四步法检验 (培养、镜检、噬菌体裂解试验、动物试验 ) ,2 份结果均为阳性 ,检出鼠疫菌 2 株。(收稿日期 2004201218)(修回日期 2004203218)(刘慧慧校 )·212· Chin J Dis Cont rol Prev 2004 J une ; 8 (3)

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