第 29 卷第 3 期Vol. 29 No. 3南华大学学报·医学版Journal of Nanhua University(Medical Edition)2001 年 6 月Jun. 2001 甘草次酸对溶血性磷脂酰胆碱损伤兔胸主动脉内皮依赖性舒张功能的保护作用 X王 茜 ① ,廖端芳 ,黄红林 ②(南华大学 药物药理研究所 ,湖南 衡阳 421001)摘 要 :目的 为观察甘草次酸对溶血性磷脂酰胆碱损伤离体兔胸主动脉血管内皮依赖性舒张功能的保护作用及机制。方法 采用离体血管环张力实验法 ,用溶血性磷脂酰胆碱 (LPC) 损伤血管内皮 ,比较使用甘草次酸前后血管环对乙酰胆碱 (Ach)的舒张比值。结果 发现甘草次酸自身对血管的舒缩功能无直接的作用 ,对 LPC 损伤的血管环舒张功能具有保护作用 ,舒张比从 0. 43 ± 0. 15 上升到 0. 60 ± 0. 16 ( P 论 环加氧酶抑制剂吲哚美辛、一氧化氮合成酶抑制剂 Nω - 硝基 - L - 精氨酸及鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝均可阻断甘草次酸的舒张保护作用 ;甘草次酸对 LPC 损伤血管内皮依赖性舒张功能的保护作用可能与促进内皮细胞释放或合成一氧化氮 (NO)和前列环素 (PGI2)有关。关键词 :甘草次酸 ; 溶血性磷脂酰胆碱 ; 血管内皮依赖性舒张功能 ; 一氧化氮 ; 前列环素中图分类号 :R961 文献标识码 :A 文章编号 :1000 - 2510 (2001) 03 - 0220 - 03Protection of Glycyrrhetinic Acid on Injury of Endothelium -dependent Ralaxtion Induced by LysophosphatidylcholineWANG Qian ① , LIAO Duan - fang , HUANG Hong - lin②( The Institute of Pharmacy & Pharmacology , Nanhua University , Hengyang , Hunan 421001 , China)Abstract Aim :To study the protective effects of glycyrrhetinic acid ( GA) on vascular endothelium - dependentrelaxation damage induced by lysophosphatidylcholine (LPC) . Methods : The vasorelaxation responses to acetylcholine(Ach) were investigated in the rabbit thoracic aortas. Results : Glycyrrhetinic acid alone did not have effect on relaxationresponse to Ach and on contraction response to phenylephrine. LPC(4 mg/ L) significantly attenuated the endothelium -dependent relaxation of rabbit aortic rings as shown by decreasing the relaxation percentage from 0. 96 ± 0. 09 to 0. 43 ±0. 15. Pretreatment of GA 2. 0 × 10 - 6 mol/ L for 10 min markdly increase the relaxation percentage from 0. 43 ± 0. 15 to0. 60 ± 0. 16. The effect of GA was blocked by prostacyclin synthetase inhibitor indomethacin(1. 0 × 10 - 7 mol/ L) , ni2tric oxide synthase inhibitor Nω - nitro - L - arginine (1. 0 × 10 - 4 mol/ L) and methylene blue (1. 0 × 10 - 4 mol/ L) . Conclusion : Glycyrrhetinic acid protects the endothelium - dependent relaxation against LPC - elicited endothelium injurywith a mechanism related to the release/ synthesis of nitric oxide and prostacyclin.Key words glycyrrhetinic acid ; lysophosphatidylcholine ; vascular endothelium - dependent relaxation ; ni2tric oxide ; prostacyclin 甘草次酸 ( Glycyrrhetinic Acid , GA) 是从豆科植 物乌拉尔甘草 ( Glycyrrhiza Uralensis Fisch) 、胀果甘草022X 湖南省教委资助课题 (NO :J Y- 00C150)①现单位为湖南医学高等专科学校 ,长沙 ,410006②为本文通讯作者 ,联系电话 :0734 - 8281408( G. Inflaia Bat. )或光果甘草 ( G. Glabra L. ) 的根及根茎中提出的有效成分 1 ,是一种五环三萜类化合物。文献 2 ～ 4 报道甘草次酸有清除自由基作用及对缺血心肌的保护作用 ,其抗氧化作用与维生素 E(VitE)相当 5 。据此 ,本实验采用离体兔胸主动脉环观察甘草次酸对内皮依赖性血管舒张功能的影响及其可能的作用机制。1 材料和方法1. 1 药品与试剂 苯肾上腺素 (Phenylephrine ,PE) 、吲哚美辛 (indomethacin , IND) 、 Nω - 硝基 - L - 精氨酸 (Nω - nitro - L - arginine ,N - L - A) 、溶血性磷脂酰胆碱 (Lysophosphatidylcholine ,LPC) 及美蓝 (Methy2lene Blue , MB) 购自 sigma 公司 ; 甘草次酸 ( Gly2cyrrhetinic Acid ,GA)购自 DELTA 天然有机化合物信息中心 (纯度 > 98 %) ,临用前用少量 1 mol/ L NaH2CO3 溶解配制成 1. 0 × 10 - 3 mol/ L 的母液 ;氯化乙酰胆碱 (Acetylcholine ,Ach)由上海试剂三厂生产 ; Kreb’s 液中各成份均为国产分析纯试剂。1. 2 离体血管环的准备和等长张力记录 选用本院动物室提供的雄性家兔 ,体重 2. 0 ± 0. 2 kg ,参照本室所建立的方法 6 ,取兔胸主动脉置入 4 ℃ Kreb’s 液中 ,细心去掉血管周围脂肪及其它组织 ,将血管剪成 4 mm 长的环数段 ,操作过程中注意保护内皮 7 。血管环悬挂在 10 ml 恒温 (37 ℃ ) 水环绕的盛有 Kreb’ s 液的浴槽中 ,连接肌张力换能器 ,用生理记录仪记录血管张力 ,浴槽中通 95 %O2/ 5 %CO2 混合气体。取静息张力 5. 0 g 平衡 90 min ,在苯肾上腺素 (1. 0 × 10 - 6mol/ L)预收缩的基础上用累加剂量的Ach (1. 0 × 18 - 8、 1. 0 × 10 - 7、 1. 0 × 10 - 6、 3. 0 × 10 - 6mol/ L)舒张血管 (血管反应良好则继续下一步实验 ,否则丢弃血管 ) ,观察 Ach 诱导的舒张百分比 ,然后用 Kreb’ s液冲洗 3～ 5 遍 ,再作如下分组处理 : (1) 正常对照组 (A) ,继续平衡 30 min ; (2)LPC 损伤组 (B) ,加入 LPC(4 mg/ L)孵育 30 min ; (3) 甘草次酸保护组(C) (在预实验中 ,我们采用 1. 0 × 10 - 7、 1. 0 × 10 - 6、2. 0 × 10 - 6、 5. 0 × 10 - 6、 1. 0 × 10 - 5 mol/ L 的 GA ,发现2. 0 × 10 - 6mol/ L GA 效应接近最大 , 1. 0 × 10 - 5 mol/L 时效应达坪值 , GA > 10 - 4 mol/ L 时 ,保护作用消失 ,故本试验选用 GA 浓度为 2. 0 × 10 - 6mol/ L) ,在加入 LPC 前 10 min 加入甘草次酸 (2. 0 × 10 - 6 mol/L) ; (4) Nω - 硝基 - L - 精氨酸、吲哚美辛或美蓝抑制组 ,分别加入 N - L - A (1. 0 × 10 - 4 mol/ L ) 、 IND(1. 0 × 10 - 5 mol/ L )或 MB (1. 0 × 10 - 4 mol/ L)孵育 10min ,再加入 GA(2. 0 × 10 - 6 mol/ L) 孵育 10 min ,然后加入 LPC(4 mg/ L)孵育 30 min。上述各组在继续用PE(1. 0 × 10 - 6 mol/ L) 预收缩的基础上 ,观察 Ach 诱导的舒张百分比。结果以舒张比 (RR = 给药后血管环最大舒张百分率 / 用药前最大舒张百分率 )表示。1. 3 统计分析 所有数据以均数 ±标准差 ( x ± s)表示 ,所有数据作方差分析后进行校正 t 检验。2 结 果2. 1 甘草次酸对血管舒缩功能的直接作用 先用PE(1. 0 × 10 - 6 mol/ L)预收缩血管环 ,用 GA 替代 Ach制备舒张效应曲线 ,不同浓度的 GA (1. 0 × 10 - 7～1. 0 × 10 - 5mol/ L)对血管环没有直接的舒张作用 ;再用 GA 替代 PE 收缩血管环 ,发现不同浓度的 GA (1.0 × 10 - 7～ 1. 0 × 10 - 5mol/ L) 对血管环也没有直接的收缩作用 ;说明 GA 不直接影响血管环的舒缩功能。2. 2 甘草次酸对 LPC 损伤血管后舒缩功能的影响 血管环与 LPC(4 mg/ L)共同孵育 30 min 后对累加剂量的 Ach (1. 0 × 10 - 8～ 1. 0 × 10 - 6mol/ L) 的舒张反应降低 ,舒张比由 0. 96 ± 0. 09 降为 0. 43 ± 0. 15 ( P 0. 001) ;血管环与甘草次酸 (2. 0 × 10 - 6 mol/ L) 共同孵育 10 min 后 ,再用 LPC 作用 30 min ,血管环对 Ach(1. 0 × 10 - 8～ 1. 0 × 10 - 6 mol/ L) 的舒张反应增高 ,舒张比由 0. 43 ± 0. 15 上升到 0. 60 ± 0. 16 ( P 说明甘草次酸可对抗 LPC 所致血管舒张功能损伤(见图 1、表 1) 。表 1 甘草次酸对溶血性磷脂酰胆碱损伤内皮依赖性舒张功能的影响组 别 n 舒张比对照组 10 0. 96 ± 0. 09LPC 12 0. 43 ± 0. 15aGA + LPC 10 0. 60 ± 0. 16bIND + GA + LPC 5 0. 42 ± 0. 10dN - L - A + GA + LPC 6 0. 16 ± 0. 09cMB + GA + LPC 6 0. 26 ± 0. 04ca : P c : P 122图 1 甘草次酸对 LPC抑制 Ach 诱导的血管舒张功能影响的原始曲线图2. 3 甘草次酸对血管内皮保护作用的机制2. 3. 1 N - L - A、美蓝对甘草次酸保护内皮作用的影响 在加入 NO 合成酶抑制剂 N - L - A (1. 0 ×10 - 4mol/ L)或鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝 (1. 0 × 10 - 4mol/ L) 后再加入 GA (2. 0 × 10 - 6 mol/ L) ,与 LPC (4mg/ L)共同孵育 ,N - L - A 和 MB 作为阻断剂均能降低甘草次酸保护后 Ach 诱导的舒张反应 (见表 1) ,说明 GA 的内皮细胞保护作用可被 N - L - A 或 MB 阻断。2. 3. 2 吲哚美辛对甘草次酸保护内皮作用的影响在加入甘草次酸前加入环加氧酶抑制剂吲哚美辛(IND ,1. 0 × 10 - 5mol/ L) ,与 LPC (4 mg/ L) 共同孵育 ,也可使 Ach 诱导的舒张反应有所下降 (见表 1) ,说明GA 的内皮细胞保护作用亦可被 IND 阻断。3 讨 论现有研究表明 ,雌激素有心血管保护作用。与男性相比 ,育龄女性不易患心血管疾患 ,而绝经后女性心血管疾病发病增多 ,雌激素替代疗法则能显着降低心血管疾病的发病危险 8 ,9 ,可使心血管疾病的发生率明显下降 (约下降 35 %～ 50 %) ,其心血管保护作用机制与内源性 NO 释放及 PGI2 作用有关。前列环素 (PGI2)和一氧化氮 (NO) 是内皮细胞合成释放的重要舒血管活性物质 10 ～ 12 。 PGI2 松弛血管平滑肌又是通过增加细胞内 cAMP 浓度 ,导致细胞膜超极化 ;环加氧酶抑制剂吲哚美辛可使 PGI2 生成减少而阻断该途径 13 。 NO 引起平滑肌舒张有两条途径 :一是引起 cGMP 增加 ,另一个是刺激 Na + -K+ - ATP 酶 ;其中 cGMP 途径可以被鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝所阻断 14 ;Nω - 硝基 - L - 精氨酸 (N - L- A)竞争性抑制一氧化氮合酶 (NOS) ,使 NO 合成减少 ,也可导致内皮依赖性血管舒张减弱。本实验发现甘草次酸能对抗溶血性磷脂酰胆碱(LPC ,ox - LDL 的主要成分 ) 诱导的内皮依赖性血管舒张功能降低 ,说明其具有保护血管内皮的作用。进一步研究发现其作用可分别被 NOS 抑制剂 N - L- A 和环加氧酶抑制剂吲哚美辛减弱 ,鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝对甘草次酸的舒张保护作用也有阻断作用。提示甘草次酸对内皮依赖性血管舒张功能的保护作用与 NO - cGMP 和 PGI2 通路有关。文献报道甘草次酸能促进大鼠体内雌二醇的合成 15 ,故推测甘草次酸具有植物雌激素样的作用 ,可望代替雌激素开发成一种具有心血管保护作用的来源丰富、性质稳定、便于生产、副作用小的植物雌激素类药物。参 考 文 献1 胡志厚 . 甘草酸类药物的研究及应用 J . 药学学报 ,1988 ,23(7) :553～ 5602 句海松 ,孙小洁 ,赵保路 . 阿魏酸钠和 18 -β 甘草次酸对氧自由基的清除作用 J . 中国药理学报 ,1990 ,11 :4663 李新芳 ,孟富敏 ,张培淡 . 18 -β 甘草次酸对鼠缺氧的作用J . 兰州医学院学报 ,1989 ,15 :1874 朱晓卫 . 甘草次酸对培养乳鼠心肌细胞的保护作用 J .中国药理学通报 ,1996 ,12(1) :745 Nagai T , Egashira T , Yamanaka Y,et al. 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N Engl J Med ,1991 ,325 : 756 ～762 (下转第 229 页 )222有氮唑类抗真菌的临床治疗药物 ,如克霉唑、皮康王、达克宁霜等 ,但由于耐药菌株的不断出现 ,因此不断研究出新的抗真菌药就十分必要 ,而研究出既有免疫调节功能又有抗真菌作用的新型药物则是其发展方向 7 。已知壳聚糖具有增强机体免疫功能 1 ,因而壳聚糖碘液作为抗真菌新型药物的开发具有远大的前景。参 考 文 献1 邵 健 ,杨宇民 ,徐秉洳 . 甲壳素和壳聚糖在生物医学方面的应用 J . 南通医学院学报 ,1997 ,17(1) :145～ 1462 张澄波 ,梅学文 ,都本业 . 脱乙酰壳多糖对肿瘤及免疫系统作用的研究 J . 中国实验临床免疫学杂志 ,1992 ,4 (1) :1～ 43 李邦良 ,高仕瑛 ,乔新惠 ,等 . 甲壳低聚糖的制备和分析 J . 中国生化药物杂志 ,1999 ,20 (6) :292～ 2944 温旺荣 ,吴定昌 ,陈 红 . RPMI 1640 液基稀释法检测氟康唑对念珠菌的最小抑菌浓度 J . 海峡预防医学杂志 ,1997 ,3 (3) :47～ 495 Abu - Isa I. α 2γ Transition in nylon 6 J . J PolymSci , 1971 , 9 :199～ 2026 高怀生 ,黄是是 ,张世达 ,等 . 碘壳聚糖生物敷料的制备 J . 中国药学杂志 ,1996 ,31 (5) :280～ 2827 Kauffman CA. 90 年代的抗真菌药 ———目前状况与今后的发展 J . 国外医学·药学分册 ,1998 ,25(1) :27～ 31(收稿时间 :2000 - 12 - 24)(上接第 219 页 )因此 ,我们认为 EBER - 1 探针原位杂交的最佳变性温度是 70 ℃左右。参 考 文 献1 Nemerow GR , Mold C , Schwend VK, et al. Identification ofgp350 as the viral glycoprotein mediating attachment of Epstein- Barr virus ( EBV) to the EBV/ C3d receptor of B cell : se2quence homology of gp350 and C3 complement fragment C3dJ . J Virol , 1987 ,61 (5) :1 416～ 1 4202 Bouille S ,Finerty S ,Pantel K,et al. Signaling through the EBV/C3d receptor(CR2 ,CD21) in human B lymphocyte J . J Im 2munol , 1999 ,162(1) :136～ 1433 Khan G, Coates PJ , Kangro HO , et al. Epstein - Barr virus( EBV) encoded small RNAs :Targets for detection by in situ hy2bridization with oligonucleotide probesJ .J Clin Pathol , 1992 ,45 (3) :416～ 6204 Anagnostopoulou I , Hummel M. Epstein - Barr virus in tumorsJ . Histopathol , 1996 ,26 (2) :297～ 3045 Liu SM ,Chow KC ,Chiu CF ,et al. Expression of Epstein - Barrvirus in patients with Hodgkin’ s disease in TaiwanJ . Cancer ,1998 ,83(2) :367～ 3716 Monterroso V ,Zhou Y,Koo S ,et al. Hodgkin’ s disease in CostaRico a report of 40 cases analyzed for Epstein - Barr virusJ .Am J Clin Pathol , 1998 ,109(5) :618～ 624(收稿时间 :2000 - 12 - 29)(上接第 222 页 )10 Taniguchi J , Furukawa KI , Shigekawa M. Maxi K+channels are stimulated by cyclic guanosinemonophosphate - dependent protein kinase in caninecoronary artery smooth muscle cells J . PflugersArch , 1993 ,423 : 167～ 17211 Robertson BE , Schubert R , Hescheler J , et al.cGMP - dependent protein kinase activates Ca - ac2tivated K channels in cerebral artery smooth musclecellsJ . Am J Physiol , 1993 ,265 : 299 ～ 30312 White RE , Lee AB , Shcherbatko AD , et al. Potas2sium channel stimulation by natriuretic peptidesthrough cGMP - dependent dephosphorylation J .Nature , 1993 ,361 : 263～ 26613 Kubo M , Nakaya Y, Matsuoka S , et al. Atrial na2triuretic factor and isosorbide dinitrate modulate thegating of ATP - sensitive K+ channels in culturedvascular smooth muscle cells J . 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