·用药指南·肝脏隔离灌注中活性炭用量对表柔比星吸附效果的影响向 莉，李 盾（暨南大学医学院第二附属医院药学部，深圳市人民医院药学部，５１８０２０）［摘 要］ 目的：研究在肝脏隔离灌注治疗肝癌过程中，活性炭作为表柔比星吸附剂的最佳用量。方法：采用含表柔比星的血浆灌注于不同组合量的活性炭罐，Ａ组（１５０ｇ×１），Ｂ组（１５０ｇ×２），Ｃ组（１５０ｇ×３），Ｄ组（１５０ｇ×４），Ｅ组（１５０ｇ×５）及Ｆ组（１５０ｇ×６），用高效液相色谱柱切换法测定表柔比星过滤前后血药浓度。结果：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ组活性炭对表柔比星的吸附率分别为（２５．６０±４．７２）％，（３８．４７±４．０２）％，（５０．１３±２．６８）％，（７０．２５±２．１７）％，（７２．０２±２．２１）％，（７３．９０±４．０２）％，经两两比较的ｑ检验，Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ任意两组间均差异有极显着性（Ｐ＜０．０１），而Ｄ、Ｅ、Ｆ任意两组间均差异无显着性（Ｐ＞０．０５）。结论：Ｄ组活性炭为活性炭吸附剂的最佳用量，该用量的确定为肝脏隔离灌注治疗肝癌提供了理论依据。［关键词］ 表柔比星；肝脏隔离灌注；柱切换；高效液相色谱法［中图分类号］ Ｒ９７８．１；Ｒ９６２．２ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １００４０７８１（２００４）０９０６７９０３ＥｆｆｅｃｔｏｆＡｃｔｉｖａｔｅｄＣａｒｂｏｎｏｎＡｄｓｏｒｂｉｎｇＥｐｉｒｕｂｉｃｉｎｉｎＩｓｏｌａｔｅｄＨｅｐａｔｉｃＰｅｒｆｕｓｉｏｎＸＩＡＮＧＬｉ，ＬＩＤｕｎ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉ＇ｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈｅｎｚｈｅｎ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＧｕａｎｇｄｏｎｇ５１８０２０，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｄｏｓａｇｅｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｒｂｏｎａｓｔｈｅａｂｓｏｒｂｅｎｔｏｆｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ（ＥＰＩ）ｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｈｅｐａｔｉｃｃｈｅｍｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｐｌａｓｍａｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎｗａｓｐｅｒｆｕｓｅｄｉｎｔｈｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｒｂｏｎｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＴｈｅｐｌａｓｍａｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｃｈｉｎｇＨＰＬＣ． Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎｂｙＡｇｒｏｕｐ（１５０ｇ×１），Ｂｇｒｏｕｐ（１５０ｇ×２），Ｃｇｒｏｕｐ（１５０ｇ×３），Ｄｇｒｏｕｐ（１５０ｇ×４），Ｅｇｒｏｕｐ（１５０ｇ×５），ａｎｄＦｇｒｏｕｐ（１５０ｇ×６）ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｒｂｏｎｃｏｌｕｍｎｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｗｅｒｅ（２５．６０±４．７２）％，（３８．４７±４．０２）％，（５０．１３±２．６８）％，（７０．２５±２．１７）％，（７２．０２±２．２１）％，（７３．９０±４．０２）％．ＴｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎａｎｙｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄｂｙｑｔｅｓｔ（Ｐ＜０．０１）．ＡｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎａｎｙｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆＤ，Ｅ，ａｎｄＦ（Ｐ＞０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｄｏｓａｇｅｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｒｂｏｎｉｓｇｒｏｕｐＤｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｄｏｓｅｉｎｔｈｅｔｈｅｒａｐｙｏｆｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒｂｙｉｓｏｌａｔｅｄｈｅｐａｔｉｃｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ；Ｉｓｏｌａｔｅｄｈｅｐａｔｉｃｐｅｒｆｕｓｉｏｎ；Ｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｃｈｉｎｇ；ＨＰＬＣ 肝脏隔离灌注化疗（ｉｓｏｌａｔｅｄｈｅｐａｔｉｃｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ＩＨＰ）作为新近开展起来的技术为肝癌区域化疗注入了新的生命力，有望成为肝癌化疗的新方向［１］。肝脏隔离灌注化疗的机制是将肝脏的入肝血流和出肝血流通过体外转流装置和体循环隔离开来，从入肝血流处注入各种大剂量抗癌药物（可达正常全身用量的３０～５０倍），对肿瘤组织发挥作用。出肝血流引出到含活性炭的过滤器，血中的化疗药物被吸附过滤后由转流泵泵入腋静脉回心［２］。表柔比星（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ，ＥＰＩ）为多柔比星的异构体，为细胞周期非特异药物，可干扰ＤＮＡ及ｍＲＮＡ合成［３］。由于表柔比星具有细胞毒性，可引起骨髓抑制、心肌毒性反应等不良反应，其不良反应发生率和外周血药浓度水平有关，在一定范围随外周血表柔比星浓度升高，其副作用加大。为选择最佳给药方案以保证用药的安全与有效，采用肝脏隔离灌注化疗［收稿日期］ ２００４０１２９ ［修回日期］ ２００４０３０５［作者简介］ 向 莉（１９６６－），女，重庆人，副主任药师，在读硕士，从事药学检验工作。降低外周血药浓度［４］，在加大局部表柔比星用量的同时，对逸出肝外的抗肿瘤药物予以清除，对于减轻表柔比星的毒性作用有重大意义。肝脏隔离灌注化疗技术利用含活性炭的过滤器作为一种清除血中药物的方法已在临床应用［５］，但其关键是吸附剂用量的多少。笔者采用不需样品处理的直接进样的高效液相色谱柱切换法［６］，测定表柔比星血药浓度，确定表柔比星在肝脏隔离灌注化疗时所用吸附剂的最佳用量，以减少表柔比星的不良反应。１ 仪器与试剂１．１ 仪器 美国Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪：２０１０系统工作站、９９６光电二极管阵列检测器、５１０双泵、７０００柱切换阀（美国Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）；ＨＬ１型恒流泵（上海医疗器械厂）；Ｒｉｏｓ超纯水器（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；分析柱ＳｈｉｍｐａｃｋＣ１８（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）；预处理柱（５０ｍｍ·０９６·ＨｅｒａｌｄｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌ．２３Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２００４×５ｍｍ），内装μＢｏｎｄａｐａｋＣ１８填料３７～５０μｍ，湿法装柱；高速离心机：上海医科大学仪器厂。１．２ 试剂 盐酸表柔比星对照品（含量９４．４％，意大利法玛西亚普强公司）；注射用盐酸表柔比星（规格１０ｍｇ，法玛西亚亚洲有限公司）；炭肾１５０（每罐活性炭１５０ｇ，血流量１００ｍＬ，瑞典金宝公司生产）；乙腈（色谱纯，德国Ｄｒｔｍｓｔａｄ公司）；磷酸（８５％，天津化学试剂批发部监制）；血浆（深圳市血液中心）。２ 方法与结果２．１ 色谱条件 分析流动相：乙腈水（３０∶７０）（８５％磷酸调节溶液ｐＨ值２．４）；流速：１．０ｍＬ·ｍｉｎ１；检测波长：２５４ｎｍ，灵敏度０．０１ＡＵＦｓ；预处理流动相：ｐＨ值２．４的磷酸溶液，流速：２．２ｍＬ·ｍｉｎ１，柱温：室温。２．２ 柱切换操作 柱切换系统流程装置见图１。样品先进入预处理柱，在预处理柱上被净化和富集，经预处理流动相冲洗，待血浆中杂质基本冲洗干净后，高压阀切换，使预处理柱和分析柱成串联状态，分析流动相进入预处理柱将保留在预处理柱中的表柔比星洗脱入分析柱进行分离测定。然后切换阀再经切回使分析柱和预处理柱断开，用预处理流动相平衡预处理柱后，即可供下次进样。柱切换操作时间表见表１，血浆测定色谱见图２，３。图１ 柱切换分离测定装置图表１ 柱切换操作时间表时间／ｍｉｎ切换阀位置分析柱中流动相预处理柱中流动相０～５预处理 分析流动相预处理流动相～１５分离测定分析流动相分析流动相 ～２０预处理 分析流动相预处理流动相２０～预处理 分析流动相待进样 ２．３ 测定方法 样品经５ｍｉｎ离心（４０００ｒ·ｍｉｎ１）后，取待测血浆４００μＬ，以醋酸缓冲液稀释至６００μＬ，旋涡混匀，取５００μＬ，直接注入ＨＰＬＣ系统，分别经预处理柱浓缩净化和分析柱分离测定。２．４ 标准曲线绘制 精密称表柔比星对照品适量，用０．１ｍｍｏｌ盐酸溶液溶解，得浓度为５ｍｇ·ｍＬ１的储备液，冷藏备用。取上述储备液，用０．１ｍｍｏｌ盐酸溶液图２ 空白血浆色谱图 图３ 表柔比星血浆色谱图稀释至一定浓度作为工作溶液。分别取健康人血浆，加入不同量的表柔比星溶液，使浓度分别为：１００，２００，４００，６００，８００，１６００ｎｇ·ｍＬ１。取上该系列浓度的血浆４００μＬ，以预处理流动相稀释至６００μＬ，旋涡混匀，取５００μＬ，进样，以峰面积（Ａ）为纵坐标，浓度（Ｃ）为横坐标作标准曲线，得线性回归方程为：Ａ＝４．６３７×１０５＋７．２８６×１０４Ｃ，表柔比星血药浓度在１００～１６００ｎｇ·ｍＬ１范围内，线性关系良好ｒ＝０．９９６１。２．５ 重现性及相对回收率试验 用空血浆配制含表柔比星１００，４００，１６００ｎｇ·ｍＬ１三个浓度的血样，按“２．３”项下处理，进样，经２０１０工作站，按外标峰面积标准曲线法自动求得样品含量，计算相对回收率，结果表柔比星浓度为１００ｎｇ·ｍＬ１的平均回收率（９３．５２±６．０５）％，ＲＳＤ＝６．４７％；４００ｎｇ·ｍＬ１的平均回收率（９４．５４±４．６２）％，ＲＳＤ＝４．８９％；１６００ｎｇ·ｍＬ１的平均回收率（９４．９７±４．３７）％，ＲＳＤ＝４．６０％。日内差（间隔１ｈ，ｎ＝５）与日间差（间隔２４ｈ，ｎ＝６），结果见表２。２．６ 样品测定结果 将炭肾按Ａ组（１５０ｇ×１）、Ｂ组（１５０ｇ×２）、Ｃ组（１５０ｇ×３）、Ｄ组（１５０ｇ×４）、Ｅ组（１５０ｇ×５）及Ｆ组（１５０ｇ×６）的用量分别串联安装，模拟肝脏隔离灌注化疗时的大剂量２００ｍｇ·（ｍ２）１，配制成４００ｎｇ·ｍＬ１的血浆溶液。利用恒流泵维持约２００ｍＬ·ｍｉｎ１血流速度，分别灌注不同组的炭肾，同时测定灌注前后的表柔比星浓度，结果见表３。经ＳＰＳＳ１０．０统计学软件处理，统计结果见表４。经多组均数间的两两比较的ｑ检验，Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ任意两组间均差异有极显着性（Ｐ＜０．０１），而Ｄ、Ｅ、Ｆ任意两组间均无显着性差异（Ｐ＞０．０５）。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ组中，Ｄ组对表柔比星的吸附率最高，故Ｄ组的用量为活性炭的最佳用量。 表２ 重现性测定结果珋ｘ±ｓ·１９６·医药导报２００４年９月第２３卷第９期表柔比星含量／ｎｇ·ｍＬ１日内差（ｎ＝５）峰面积ＲＳＤ／％日间差（ｎ＝６）峰面积ＲＳＤ／％１００ ６９５６９３１±４９９１６７７．１８ ６９３１７６９±５２１４７２７．５２４００２８５２８６４３±１７９１８７８６．２８２８６４５３９７±１８７９３５４６．５６１６００１１２４２９８４８±６２４２９８４５．５５１１１９４８９７２±６９６３２３５６．２２ 表３ 样品测定结果珋ｘ±ｓ，ｎ＝５组别活性炭量／ｇ血药浓度／ｎｇ·ｍＬ１滤前滤后表柔比星透过率／％表柔比星吸收率／％Ａ组１５０×１４００２９７．５９±１８．８９７４．４０±４．７２２５．６０±４．７２Ｂ组１５０×２４００２４６．１０±１６．０９６１．５３±４．０２３８．４７±４．０２Ｃ组１５０×３４００１９９．４７±１０．７１４９．８７±２．６８５０．１３±２．６８Ｄ组１５０×４４００１１８．９８±８．６７２９．７５±２．１７７０．２５±２．１７Ｅ组１５０×５４００１１１．９０±８．８２２７．９８±２．２１７２．０２±２．２１Ｆ组１５０×６４００１０４．４１±１６．０７２６．１０±４．０２７３．９０±４．０２表４ 方差分析表差异源离差平方和自由度均方Ｆ值临界值组间１０２０２７５０．２０４０５０１７１．５７Ｆ（０．０１）＝３．８９５１组内０．０２８５４２４０．００１１８９Ｆ（０．０５）＝２．６２０７３ 讨论①６组不同活性炭用量的炭肾对表柔比星均有吸附作用，Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ组随活性炭用量的增加其吸附作用增强，Ｄ、Ｅ和Ｆ组随活性炭用量的增加其吸附作用无明显变化，故Ｄ组（１５０ｇ×４）炭肾为活性炭吸附剂的最佳用量。该用量的确定可为临床采用表柔比星肝脏隔离灌注治疗肝癌提供理论依据，对于减轻表柔比星的毒性作用有重大意义。②在测定血药浓度时采用了仅对样品进行离心处理后便直接进样这一简便的样品处理过程，这是因为在柱切换ＨＰＬＣ法测定生物样品时，生物样品只需离心处理，不需要任何其他预处理即可进样。由于蛋白质及其他内源性杂质（通常极性较大）受亲水性外表面的作用和孔径大小的限制，被直接洗脱下来，而被分析物在洗脱至分析柱之前被吸附在填料孔隙之中，得到净化和富集，然后切换至与分析柱相连接，以分析流动相将被分析物从预柱洗脱至分析柱，进行分离测定。从而提高了检测效率，避免了传统的ＨＰＬＣ法因蛋白质与流动相中的有机溶剂发生作用、产生沉淀，使色谱柱堵塞所至不能直接进样的缺点［７］。③由于预处理柱为手工湿法装柱，对表柔比星的色谱峰有一定影响。为避免表柔比星的色谱峰在预处理柱中的展宽，采用预柱反冲方式进行柱切换操作，同时也提高了方法的灵敏度。为提高选择性，可加入离子对试剂，使能形成离子对的组分在一级柱上展宽的可能性降低。④柱切换为高效液相色谱法测定生物样品开拓了广阔的空间，本实验充分利用柱切换法不需用内标物等优点［８］，同时保证了进样体积大，且处理样品的全过程由仪器程序控制。⑤本实验的回收率是相对回收率，是血浆为标准品时所测定的相对回收率，该回收率结果比以水为溶媒进样时的绝对回收率约高２０％。［参考文献］［１］ 郭跃华，余小舫，鲍世韵．肝脏隔离灌注化疗的研究进展［Ｊ］．医学综述，２００２，８（２）：９８－１００．［２］ ＫｕＹ，ＦｕｋｕｍｏｔｏＴ，ＩｗａｓａｋｉＴ，ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｐｉｌｏｔｓｔｕｄｙｏｎｈｉｇｈｄｏｓｅｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｄｉｒｅｃｔｈｅｍｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎｕｎｄｅｒｈｅｐａｔｉｃｖｅｎｏｕｓｉｓｌａｔｉｏｎｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｄｖａｎｃｅｄｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９５，１１７（５）：５１０－５１９．［３］ 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