蛋白质组分析中变形链球菌的酸耐受性代谢表型爱丽丝氯莱恩，德里克是哈蒂和尼古拉斯答雅克牙科学院的研究，韦斯特米德千年研究所和口腔健康韦斯特米德中心，邮政信箱533，Wentworthville，NSW，澳大利亚2145摘要双向凝胶电泳的蛋白质组分析链球菌变形链球菌生长在一个稳定的状态在一个葡萄糖有限厌氧连续培养揭示了时出现的差异表达的生长pH值降低到蛋白质数量pH值7.0至pH 5.0。在代谢蛋白表达的变化，一般限于3生化途径：糖酵解，产酸的替代和支链氨基酸的合成。代表的蛋白质与恩布登-迈尔霍夫-帕尔纳斯途径相关酶的所有景点的相对表达水平，以及在主要替代变形链球菌发酵酸途径参与所有的酶，但一，鉴定和测量。蛋白质组数据与最终产品和细胞产量的分析结合起来，进行了表型改变，允许变形链球菌增殖的消耗能量，在低pH值从细胞挤出多余的氢离子相一致，同时尽量减少不利影响，该结果从代谢偶联的碳通量和NADH和丙酮酸生产在随后的不平衡。在酶水平的变化与在最强的酸，甲酸，这是一个对丙酮酸转移的结果既乳酸和支链氨基酸生产时变形链球菌在酸性环境下栽培的形成目标一致。缩略语：2胃排空，双向凝胶电泳;的ASB - 14，amidosulfobetaine - 14;研发，稀释率;署署长，差异表达（值），IPG集团，固相pH梯度;新闻通讯社，胞内多糖;的MALDI - TOF法，矩阵辅助激光解吸电离时间飞行，PEP的，警校，磷酸：葡萄糖磷酸转移酶系统;产品市场管理，肽质量映射; YATP，ATP的产量，每摩尔ATP的细胞干重; YGlc，细胞产量，每摩尔葡萄糖细胞干重龋齿引发的是与临床相关产酸和耐酸细菌分泌和容忍的有机酸性发酵的碳水化合物代谢副产物。通过它们对牙齿珐琅质除盐作用，这些有机酸都发起并有助于疾病的病因。在过去50年中，龋齿的研究集中于口腔链球菌，尤其是变形链球菌，目前接受的是与他的病（滨田斯莱德，1980年;哈珀＆莱歇，1984年开始相关的各种形式;莱歇，1986年;面包车乌特，1994年;车Ruyven等。，2000）。许多研究一直致力于研究链球菌糖代谢，特别是生物化学和允许变形链球菌产生酸和生存在口腔内pH值低的生理适应。从历史上看，本研究采用了一种还原论的方法来研究，如酶的变构调节和代谢通量的改变（岩见及山田，1980年;汉密尔顿，1984年;山田，1987年;卡尔松和汉密尔顿，1996年; Quivey等生化过程基地。，2001）。一个最近的一些报告，但已较全面的战略使用蛋白质组分析功能来重新评估在变形链球菌耐酸机制。例如，通过双向电泳（2-胃排空的14C标记的细胞蛋白质）的分析显示了64个蛋白质上调，以及49项下调，当细胞从震惊pH值7.5至pH 5° 0。这些蛋白质的身份仍有待确定（Svensäter等。，2000）。在一项相关研究中，18个蛋白质上调和12个下调时，比较了S的2 -胃排空蛋白质组变形链球菌生长在了一批文化，没有启动的pH值控制7.0和5 pH值，· 2。由质谱分析，确定了27个蛋白质，13人参与糖代谢的运输和中部（威尔金斯等人。，2002）。在这后一份报告，变形链球菌是在收割和分析中指数的阶段，在这阶段，两地文化的pH值下降到6.2和4.7，分别为。值得注意的不同代次获得，1.0h和6.6h的两个pH值（威尔金斯等人。，2002）。这是在培养一批pH值的变化作出了在蛋白质难以观测到的变化的了解，以评估有关pH值衡量，因为细胞培养一批收获不断应对不断变化的外部环境。相反，连续培养法在本研究使用具有让细胞来在稳定状态下严格界定的条件采样的优势，从而使真正的比较蛋白质组分析时individual参数的改变。在目前的研究中，变形链球菌蛋白质组，稳定增长状态，在pH在人工唾液中的定义7.0，已经与在pH5.0生长的细胞进行比较。这种方法已被选定为模仿更容易与主机的比较在一个健康的人牙菌斑的条件。同时，在一个层面上，这一分析强调了在耐酸性的表型的适应程度，它已在另一个显示，在对蛋白质表达水平的变化似乎只限于关键的代谢途径;值得注意的是，糖酵解，产酸，和对支链氨基酸的合成。相对于以往的研究在无（Svensäter等。，2000），或少于18％（威尔金斯等人。，2002年）在这些通路的蛋白质进行检测，本研究发现在这三个83％的酶生化途径。该数据与假设一致，即变形链球菌适应酸性环境，减少氢离子的生产，使用了一系列不同的战略。这是如此，尽管对ATP对H +分泌和利用由此产生的碳同化过程解耦需要从流失。菌株及生长条件。变形链球菌LT11（道等人连续的文化。，1993）厌氧条件下生长在一个贫化率（四）0.100±0.001的H- 1，在pH7.0 ±0.1或pH值5.0 ± 0.1与葡萄糖的养分限制，如前面所述（雅克等人。，1979）。用万用表中，没有粘液，但修改为包括腺嘌呤，鸟嘌呤和尿嘧啶在20微克毫升-1，15毫米和15 mM的磷酸氢二钾磷酸二氢钾（锡松斯等。，1991）。分析表明，变形链球菌是有限的葡萄糖在D= 0.1 h - 1的，都在pH7.0和pH值5.0，因为99.8％和99.9％，分别是葡萄糖，在培养基为利用，而添加的氨基酸都保持在pH值7.0和72％，超过（平均利用率为75％，在pH 5.0）。制备细胞蛋白质。当已经达到稳定状态，在培养容器的细菌含量，收获，清洗及冻干，然后等分（10毫克干重）的细胞经mutanolysin（莱恩等人。，2003）。蛋白质是要在酸性固相pH梯度（IPG集团）条（pH值4.0 -6 ° 7）如前面描述的提取（莱恩等人分开。，2003年），除了1％（瓦特/V）的amidosulfobetaine-14（ASB的- 14）和65毫米数码地面电视的生产增加了一个修改为2解磷解胃排空。虽然这些试剂的加入提高了蛋白质可以随时在2看出胃排空凝胶点的总数，将其列入选择性抑制提取或一弱先前已经表示，可视化和蛋白质少数随后分离/或确定在2胃排空凝胶（莱恩等人。，2003）。蛋白质是在基础IPG胶条（pH值6-11）是从mutanolysin处理的细胞获得两部分溶程序分开。下面的细胞裂解液（12000克，4℃，10分钟）离心，细胞沉淀是储存在-20°C和蛋白质的沉淀上清于-20°，15％（重量/体积ç过夜）三氯乙酸。经过离心（12 000克，4℃，10分钟）和2名甲醇洗涤，沉淀的蛋白质溶解在300微升1：1混合改性增溶液（无的ASB- 14）细胞及细胞器膜和增溶试剂（Sigma- Aldrich公司），含1％（5 / 5）剂Triton X- 100及2mm丁基。被冻结的细胞沉淀解冻，再由超声波悬浮（布兰森超声波，50瓦，10x10秒，与彼此间爆裂冰制冷）在700同一溶解微升。核酸外切酶Ⅲ（150 U）的加入，在室温（20-22°C下15分钟的暂停），以降低任何的DNA。这两个细胞体进行合并，在室温（12000克，20-22℃，10分钟）离心。在此之前国际盛事基金，100微升碘乙酰胺（500毫米）的混合物中加入在室温（20-22°C下）2小时2胃排空。为了分开2胃排空，该蛋白的细胞中提取0.75毫克干细胞重量相当于酸性蛋白溶解于150微升改性上窄范围2-胃排空解磷解决方案之前，杯装（pH值4.0 -5 ° 0，4.5和5.5 -5 ° -6 ° 5 7）IPG胶条（Amersham公司生物科学），预先与350相同的修改2胃排空解磷解微升肿胀。对于基本的细胞蛋白，IPG胶条（pH值6-11;阿麦斯罕生物科技公司）首次改良2胃排空解磷解前肿胀，没有的ASB- 14，但含10％（5 / 5）2 -丙醇。细胞蛋白提取相当于1毫克的干细胞重当时杯装上IPG胶条。此修改导致了更好的2-胃排空的基本蛋白质的决议。蛋白质主要集中在20°C时使用一个Multiphor第二电泳系统（Amersham公司生物科学）蛋白质集中在狭窄的范围IPG胶条一1.415 KVH的（100伏7小时，由300伏随访6小时，2小时1000，2500为2小时，3500 2 H和V V V总5000 V的25 h）和一79.8 KVH的（100伏2小时，由300伏随访2小时，1000年为2小时，2小时2500，3500 V VV总就广泛的范围IPG胶条12小时和6小时5000五）。继上10-18％不亚于维梯度的SDS- PAGE分离，凝胶进行染色与Sypro红宝石的图像分析，然后被双染通用模块构建与考马斯亮蓝的G- 250为现货切除，胰蛋白酶消化和质量光谱分析（莱恩等人。，2003）。1998年第03 Sypro红宝石染2凝胶蛋白斑点胃排空高度重复性观察样品间从同一生长pH（数据未显示）获得。密度/体积，或差异表达（DE）的价值（任意单位）各Sypro红宝石染蛋白质点，决心用软件Z3的（Compugen）。在这项研究中，与此相关的量化形式主要来源是错误的2-重复性胃排空显示自己，因为生物的变化是通过对文化的恒化器，以减少使用的细菌。这2-胃排空显示是错误的主要来源是通过比较随机选择的25个蛋白点，从广泛的范围IPG胶条（pH值4.0 -7 ° 0）分离2署署长胃排空显示选定值确认。从样本一式三份等价蛋白连续培养3个重复每个点进行了分析。这些数据证实，2胃排空是错误的决定署署长值的主要来源。因此，各一式三份的pH值在细胞生长的实验样本为所有2，使用胃排空的分析，以及在现场的蛋白质expression水平的提高是基于在平均署署长价值的变化。蛋白异构体。一词异构体是用在这里来描述多收取的一种蛋白质，在2胃排空凝胶，在那里观察到的平均从第二个（经SDS- PAGE）尺寸计算出每种形式存在形式议员偏离了5％或以下，和那里是没有肽质量退化任何形式的截断或映射的证据。质谱分析。胰蛋白酶在凝胶消化，浓缩，低拷贝数蛋白脱盐，和基质辅助激光解吸电离时间飞行（的MALDI- TOF）质谱分析，进行（如前面所述）在每个点的蛋白质是独特的差异或在pH7.0或pH值5.0，或者形成利益的代谢途径（莱恩等人的部分表示。，2003）。大规模从复制在两个增长pH值2胃排空凝胶，每个蛋白质点光谱分析，用确认已经由Z3的软件匹配蛋白质的身份。蛋白质鉴定。肽质量映射（产品市场管理）的蛋白质进行了分析，如前面所述，使变形链球菌UA159的重叠群使用的6个基因组10月6日2001年在所有六个阅读框（莱恩等人翻译的下载。，2003年）。最初的6个重叠群中使用了这种方式在这些重叠群发现一些基因没有在最后的注释本中。蛋白质鉴定参数包括150ppm的群众性和每一个错过肽卵裂一最大，同时考虑蛋氨酸和半胱氨酸亚砜酰胺修改服用。比赛被定义了匹配肽群众，占总数的百分比由肽序列覆盖人数的基础。作为一般规则，至少25％的总序列覆盖被带到匹配一个给定的ORF与信心的高先生蛋白翻译，但覆盖面高达80％是观察到许多低蛋白议员。所有的翻译个ORF产品市场管理相匹配的数据，然后用于查询注明在口腔变形链球菌病原序列数据库（http://www.stdgen.lanl.gov/oragen基因组），使用本地BLAST的搜索工具，以确定该基因识别号码。名称中使用的所有基因都与口腔变形链球菌在病原基因组序列数据库关联的网站。先生的理论和PI的确定，采用MassLynx软件版本3.4（微团）。氨基酸分析。在花中的游离氨基酸含量进行分析柱前6- aminoquinolyl -的N -羟基氨基甲酸酯衍生化，采用水AccQFluor试剂盒（科恩及米肖，1993;科恩及DeAntonis，1994）。氨基酸衍生物进行了分离和量化反相（C18柱）高效液相色谱法，使用水AccQTag列（15 cmx3 · 9 mm内径），根据制造商的协议（科恩，2001）。高效液相色谱法进行了一水联盟2695分离模块，474荧光检测器和2487双升吸光度检测器，串联。控制和分析软件水域赋权临模块。色氨酸进行了分析紫外检测，荧光检测和所有其他氨基酸。代谢产物分析。葡萄糖的浓度，醋酸，乙醇，甲酸和乳酸在稳态测量中目前使用适当的检测试剂盒（罗氏enzymically），根据制造商的指示（哈蒂及汉德利，1988）。胞内多糖的累积金额（IPS）的测定等人的DiPersio碘化钾法。（1974年）。一个稳态组合连续培养技术，缩小范围IPG胶条允许检测，对Sypro红宝石染2胃排空凝胶，155个蛋白点差异表达的细胞超过1.5倍时耐酸增长上调变形链球菌在pH值5.0。其中，123人确定了质谱分析，并发现与53个法规和相关/或压力的反应途径（莱恩等人。，2004）。其余70个蛋白点都与代谢;大部分是与糖酵解有关的，替代产酸和支链氨基酸的合成（表1）。  表1。代谢蛋白表达的差异变形链球菌生长在pH7.0和pH5.0基因身份证，在口腔变形链球菌在病原序列数据库网站（http://www.stdgen.lanl.gov/oragen基因组相关基因的名称）。葡萄糖的吸收和质子挤压在pH值7.0，变形链球菌优先运输的酶的第二高亲和力物磷酸葡萄糖：葡萄糖磷酸转移酶系统（PEP的，警校），清理垃圾葡萄糖分子（埃尔伍德等人的能力。，1979）。两个这样的系统存在变形链球菌：EIIman，已得到很好的特点，并EIIglc，它们的存在主要是基于对生理性意见（Vadeboncoeur，1984;内龙＆Vadeboncoeur，1987）。然而，连续的文化研究表明，变形链球菌是完全缺乏EIIman和EIIglc活动，在pH5.0（Vadeboncoeur等。，1991）。在这个酸性pH值，细菌优先利用非警校葡萄糖通透系统（汉密尔顿和圣马丁，1982年; Dashper与雷诺，1990年;巴克利和汉密尔顿，1994年），同时保持增加其质子水平较碱性细胞质-移位F1F0 -ATP酶（汉密尔顿和巴克利，1991年;Cvitkovitch等。，1995）。在最近的变形链球菌基因组注释，但没有确定具体的基因编码葡萄糖通透（Ajdi等。，2002）。质谱分析没有发现任何与固有膜中变形链球菌葡萄糖摄取的蛋白质。由于未能检测革兰氏阳性菌固有的疏水膜蛋白变性是一种带有2胃排空蛋白质组分析（莱恩等人共同的问题。，2003）。尽管有此限制，两个细胞质组成形式，EIIABman（ManL）的EIImanPEP的，警察训练学校，被确定（图1，表1）。不幸的是，这两种形式，对16060名议员和14940 ±80 ±30电点4.44±0.05和4.46±0.02，分别的（n，= 6），分别为C-末端截断。他们只代表了部分蛋白质EIIA，肽质量指纹以来覆盖区域仅限于EIIA（数据未显示）。虽然EIIman人教版，警校EIIABman组件已申报为组成型表达变形链球菌（Vadeboncoeur，1984年），该蛋白质被截断的性质，本研究发现严重限制了观察到的6.8倍下降的解释调节这些蛋白质在pH值5.0。这种限制也适用于是否下调反映了在PEP的葡萄糖，这些酸性条件下警校（图1，表1减少使用问题）。  图。1。比较表达，在细胞生长，在pH 7.0或5.0的葡萄糖运输和糖酵解有关的变形链球菌蛋白。在椭圆柱代表的相对平均DE值（任意单位）每个蛋白点在2胃排空凝胶鉴定。可选择丢弃值大于100万个是一个高度打破所示。在pH值5.0，蛋白点进行上调（绿色），下调（红色），非差异表达（  相反，葡萄糖激酶（GLK级），所需的任何自由进入的方式通过一项通透细胞葡萄糖依赖ATP的磷酸化，是最新的2.1倍，在pH 5.0规范。但是，由于葡萄糖激酶拥有约8.0（波特等人的最佳pH值。，1982年），其相对活性和稳定性受到影响在5.0，生长pH，内部pH值会减少由细胞质酸化比6.5（Dashper与雷诺，1990年;汉密尔顿，1990年;石见等。，1992）。由于对糖酵解最适pH似乎是7.0（Dashper＆雷诺兹，1992年），在细胞质pH值下降最可能解释了为什么葡萄糖激酶是糖酵解的速率控制步骤时，细胞悬浮在pH值7.0在低增长pH值在体外（岩见及山田，1980）。在观察蛋白质的增加可能因此只反映了需要克服这种抑制作用在细胞内，在pH5.0的增长。在变形链球菌的质子移位F1F0- ATP酶的挤出氢离子耐酸研究已受到相当的重视，是因为链球菌质膜质子渗透（班德等人。，1986）。一个在（AtpA）和3.6的了F1这项复杂组件（AtpC）亚基倍观察7.5倍，在pH 5.0（图1，表1）。这种观察与显示的H+ - ATPase的变形链球菌增加因应环境酸化水平，以维持一个跨膜pH梯度（pH值）与细胞内部，更多的碱性（贝利及以前的数据相一致侯爵，1991年;汉密尔顿和巴克利，1991年; Dashper与雷诺，1992年; Quivey等。，2001）。糖酵解葡萄糖进入细胞中，无论是人教版，警校或通透/葡萄糖激酶通路，进入恩布登-迈尔霍夫-帕尔纳斯葡萄糖6磷酸糖酵解途径，并转化为丙酮酸。作者在对2个蛋白点确定胃排空凝胶（图1，表1个不同途径的酶每本）。在该恩布登-迈尔霍夫-帕尔纳斯通路上半年代谢中间体上形成的分析表明，6级的葡萄糖磷酸略有升高时，变形链球菌是在连续培养生长在pH5.5和D= 0.15的H- 1，而所有其他中间体的含量基本相同，直至并包括磷酸二羟丙酮和甘油三磷酸（岩见等。，1992）。在此基础上，葡萄糖-6磷酸异构酶（简称GPI增加一倍）和整体1.5倍的果糖1,6二磷酸醛缩酶（的FBA三个亚型水平的提高），类似于以前观察在分批培养（威尔金斯等人。，2002年;图。1，表1），可能反映了需要克服，在pH5.0的细胞质酸化对酶活性的影响。有些保健应在行使这种简化的解释，但是，因为双方都果糖6磷酸和甘油三磷酸可能需要作为转酮酶底物（TKT公司），以增加在pH5.0核糖核酸合成（见下文）。不仅是在ATP的形式在糖酵解产生能量，但合成代谢反应也前兆。例如，一个特定的变形链球菌具有辅酶Ⅱ依赖性甘油三磷酸脱氢酶（GapN）绕过第一个ATP产生的糖酵解步骤，以生成还原（布朗Wittenberger，1971a合成反应所需的NADPH;乌鸦＆Wittenberger，1979年;博伊德等。，1995;图。1）。这种酶是必不可少的，因为变形链球菌具有既不属于戊糖磷酸循环氧化的部分，也不是对辅酶NADH的所（布朗和Wittenberger，1971b减少transhydrogenase）。2.0 - 3.4倍增加的辅酶Ⅱ依赖性甘油三磷酸脱氢酶的两个异构体量平均在pH5.0，随着对异构体的含量变化与NAD依赖甘油三磷酸脱氢酶（GAPDH）和磷酸激酶（精确制导组件），强调通过通路的两个分支（图1，表1）在确定碳通量的困难。然而，自1代表整体2.7倍，辅酶Ⅱ依赖性甘油三磷酸脱氢酶增加近两倍，在pH 5.0在其他两个替代糖酵解氧化酶的每个分支的累积水平的提高，这表明，辅酶Ⅱ依赖性甘油三磷酸脱氢酶可能确实是最重要的是决定这个方向。这将是在与合成代谢活动所需，以维持高如蛋白质和DNA在非最佳酸性细胞质（乌鸦与Wittenberger，1979年; Quivey等的分子水平保持结构完整性。，2001年;莱恩等人。，2004）。这种观点是完全支持2-胃排空凝胶在pH5.0的一个高层次的转酮酶（TKT公司）检测。转酮酶形成的糖酵解途径重定向到磷酸戊糖途径甘油三磷酸果糖和6-磷酸交界处，并最终合成核苷酸（图1，表1）。3种酶参与了3-磷酸最终转化为丙酮酸。其中第一，phosphoglyceromutase，是由6个代表在变形链球菌基因组（Ajdi等等位基因。，2002）。在这两种蛋白质的检测产品，一（PmgY）在pH为5.0，而其他（PGM）中是在此pH值（图1，表一缺席上调2.7倍）。最后糖酵解酶，丙酮酸激酶（Pyk），4个亚型也上调了2.4，在pH 5.0 -7.1 - 2.3 - 7.8倍，分别为。丙酮酸激酶被认为是关键的速率限制在变形链球菌糖酵解调节步骤，因为它是由葡萄糖6磷酸激活的，而是由无机磷（山田和卡尔松，1975年b;阿贝和山田，1982年抑制;石见与山田，1980）。然而，对在恩布登-迈尔霍夫-帕尔纳斯糖酵解酶的主要形式前减少93％，烯醇化酶（伊诺），连同其他轻微高先生和截断形式的减少，预计将有显着对碳，在pH5.0流，尤其是在烯醇化酶的最适pH为7.5（Bunick＆Kashet，1981）。由于在连续培养变形链球菌生长，是衡量葡萄糖项目开发缺乏警校活动，在pH5.0（Vadeboncoeur等。，1991年），磷酸无须启动该摄取葡萄糖的磷酸化级联系统。在pH5.0的最后三个糖酵解酶水平与减少的磷酸池，因为烯醇化酶水平的下降与整体2.8倍，丙酮酸激酶的四个异构体的增加，同时，一致将预期到二，磷酸丙酮酸没有向任何集结磷酸。这个想法是支持四个中间体，三磷酸，2磷酸，磷酸和测量在S丙酮酸，在pH5.5和D= 0.15变形链球菌生长的H- 1，其中3人的水平-磷酸和磷酸减少，2-磷酸这仍然未变，丙酮酸增加（岩见等人的数额。，1992）。这是由另一进一步研究，其中一个细胞内pH值下降可以显着提高丙酮酸：磷酸比（岩见及山田，1980）的支持。磷酸也是L-乳酸脱氢酶（山田和卡尔松，1975年b;山田，1987年）抑制剂，这种代谢物如此之低的水平将允许更高的乳酸浓度，在pH5.0的积累，如确实如此（表2，见下文）。  表2。生长pH值对产量和最终的代谢产物变形链球菌在S数字代表了至少3确定的意思。YATP决心根据哈蒂及汉德利（1988）的假设。NAD的再生在变形链球菌，丙酮酸可以转化成酸性终端产品（图2）新品种。在有氧环境下，变形链球菌利用丙酮酸脱氢酶丙酮酸转换为乙酰辅酶A（卡尔松等人。，1985）。尽管这种酶，应根据本研究利用经济增长的厌氧条件不活跃，在两个多酶丙酮酸脱氢酶复合物的三个组成部分，乙偶姻脱氢酶E1的组成部分，（AcoB），和C -末端片段对二氢的S-乙酰转移酶（AdhC），确定了2-胃排空凝胶（图2，表1）。  图。2。比较表达，在细胞生长，在pH7.0或5.0，在NADH氧化变形链球菌参与蛋白质和葡萄糖的替代使用6磷酸盐。在椭圆柱代表的相对平均DE值（任意单位）每个蛋白点在2胃排空凝胶鉴定。在pH值5.0，蛋白点进行上调（绿色），下调（红色），非差异表达（在厌氧条件下，在过量葡萄糖，L -乳酸是由L -乳酸脱氢酶（LDH）。在降低丙酮酸为L -乳酸，NADH的氧化为NAD和细胞的氧化还原平衡得以维持。但是，在厌氧条件下，当葡萄糖限制，这种细菌依靠丙酮酸甲酸裂解酶途径，它有两个分支，导致无论对甲酸和乙酸或乙醇的形成（卡尔松和格里菲斯，1974;山田形成与卡尔松，1975年b;山田，1987）。乙醇分支包括两个步骤，其中有2NADH的氧化为2NAD的。在变形链球菌，这两个步骤，其中乙酰辅酶A是先转换为乙醛，然后到乙醇，是由双功能酶催化，酒精，乙醛脱氢酶（粘附）。在通路，一个额外的ATP的生成醋酸分公司为乙酰辅酶A，先转换为磷酸盐，然后乙酰乙酸，与随之而来的ADP的转化为ATP的影响。通过对醋酸和丙酮酸，甲酸裂解酶途径适当使用乙醇分行，变形链球菌可以随时调整NADH氧化实际需要。如果没有进一步的合成代谢的最终产品转移，由糖酵解产生甲酸金额相当于醋酸和乙醇总量。蛋白质组分析显示，在2胃排空凝胶检测L-乳酸脱氢酶的两个亚型被上调，在pH5.0 2.5 - 1.7倍，而在pH值7.0的水平。这些值是类似于一共有1.7倍报告所指出的关于L-乳酸脱氢酶中变形链球菌的三个亚型2和胃排空凝胶口腔链球菌生长时的5个亚型无批次pH值控制文化（威尔金斯等人。，2001年，2002年）。在L-乳酸脱氢酶同工酶增加我们的研究中观察到的是不太可能的解释在根据（表2）酸性条件下生产的L-乳酸量127倍，尽管L-乳酸脱氢酶具有广泛的在酸性催化活性的最佳pH值范围5.0 -6 ° 2，类似的pH值范围6.0 -6 °的细胞的细胞质5 pH值增长5.0（Dashper与雷诺，1990年;汉密尔顿，1990;石见等。，1992）。更有可能的解释是，这种酶是糖酵解中间调节pH值在较低的增长（山田和卡尔松，1975年b;高桥等人。，1982年;山田，1987）。虽然没有在对丙酮酸甲酸裂解酶表达水平的变化是在目前的研究发现，由于没有检测到酶2-胃排空凝胶（图2，表1），酒精，乙醛脱氢酶同工酶的6人，平均下调7.0倍，在pH 5.0，而众多的C-末端截短形式是在这个pH值或下调或丢失。醋酸激酶（AckA）在醋酸分支，也下调了2.1因子调控。相反，对磷酸转水平的提高，在pH5.0度（PTA1.7倍;图。2，表1）。尽管一般的蛋白质表达减少整体观察在丙酮酸甲酸裂解酶途径这两个分支2凝胶胃排空，增加数额甲酸，乙酸和乙醇，在pH5.0生产与被4·乙醇的水平，6倍，在pH大于7.0（见表2）。这个观察可以解释主要是由增加糖酵解率（汉密尔顿，1984年）生产所需的pH值在5.0（本德尔等三磷酸腺苷对H+挤压铝。，1986;贝利和侯爵，1991年;汉密尔顿和巴克利，1991年;宫城等基地。，1994;史密斯等人。，1996）。事实上，有一个碳在pH5.0徒劳的使用是在ATP的产量均减少测量反映，（YATP;哈蒂及汉德利，1988）由16.9至3.9克（干重）细胞每摩尔三磷酸腺苷，细胞产量（YGlc）由28.0，至15.1克（干重）每摩尔葡萄糖，当pH值的增长从7.0降低到5.0细胞（表2）。但显然没有阻止替代酸生产，问题是是否在乙醇和丙酮酸甲酸，醋酸酶通路分行成为限制酶水平降低，在pH5.0的细胞生长，并通过这样做提高了流动丙酮酸通过L-乳酸脱氢酶途径。支链氨基酸的形成甲酸盐在下降：（乙+乙醇）的比例，从理论的最高值1.0糖酵解值的0.56，在pH 5.0观察（见表2）。由于醋酸浓度为两个pH值相似，但在pH5.0的甲酸相对减少变形链球菌建议，这是进一步代谢酸。替代方案的乙醇产量的增加被其他代谢过程，可以排除，因为酒精只能通过丙酮酸甲酸裂解酶途径形成。比较蛋白质组分析建议，在pH5.0的甲酸命运在于一些的支链氨基酸的生物合成途径，由于增加了与此氨基酸途径，在pH5.0（图观察单相关的酶。3和表1）。连接时，由于异亮氨酸生物合成需要2-乙酰，这是由丝氨酸苏氨酸得到去酰胺酶铵（IlvA，欧共体4.3.1.19）。丝氨酸形成了一个由碳循环的方式捐助甲酸。这两个亮氨酸和缬氨酸生物合成，另一方面，依靠直接丙酮酸（图3）。然而，归根结底，支链氨基酸的生物合成需要合成的亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸都丙酮酸和NADPH。德这些氨基酸从头合成两种方式可以减少产酸，减少直接消除了丙酮酸和2-乙酰现金等价物形式，间接由NADPH的（图3）消费。此外，减少甲酸水平也降低了H+浓度，由于甲酸是一种强酸性（pKa值3.75）高于或者乳酸（pKa值3.86）或乙酸（pKa值4.75）。  图。3。比较表达，在细胞生长，在pH7.0或5.0的支链氨基酸参与蛋白质合成变形链球菌。在椭圆柱代表的相对平均DE值（任意单位）每个蛋白点在2胃排空凝胶鉴定。蛋白质点上升，在pH值5.0（绿色），并下调调节pH值在7.0（红色）。蛋白质不能鉴定蛋白质组分析，在淡蓝色的矩形显示。括号中的数字对应的蛋白质数目表1。  在pH值5.0，缩酮，酸还原异构酶四个亚型（IlvC）被上调3.9- 5.7 - 2.6 - 3.5倍，而支链氨基酸氨基转移酶（IlvE）和谷氨酰胺合成酶（GlnA）被上调2.7- 8.7倍，分别为（图3，表1）。对支链氨基酸转氨酶产品，2oxoglutaric酸（-酮戊二酸），也比谷氨酸较弱酸，与2.8和5.0的pKa值，相对于2.2和4 pKa值· 2为谷氨酸的羧基。支链氨基酸会形成以来，所有3个氨基酸的生物合成一个额外的好处，涉及氨由谷氨酰胺合成酶的形成。这氨气，加上从丝氨酸生产异亮氨酸生物合成的过程中，将提供一个缓冲在生长pH为5.0的酸性细胞质中变形链球菌的替代机制，因为氨会与H+发生反应形成（图3）。有趣的是，丙酮酸激酶活性有一个或钾离子，或和一个不似乎不利于（阿贝与山田，1982年;山田，1987年; Pitty和雅克，1989）口腔链球菌生长高浓度的强制性要求。对于一个支链中的作用链球菌生存氨基酸生物合成在低pH值的支持来自最近的两个观测。在嗜热链球菌中，支链氨基酸的生物合成途径已被认为是必要的，但并不足以确保最佳生长，并已发挥作用，在维护（内部pH值Garault等途径推测。，2000）。差分显示RT- PCR检测还表明，支链氨基酸转氨酶是上调在酸性条件下变形链球菌，而ilvC灭活导致生长迟缓，在pH5.5（嘉等。，2001）。一个为支链的作用pH值在保持国内氨基酸合成的进一步支持来自一个事实，即2-乙酰乳酸是由乙酰乳酸合成酶（人工肝支持系统，欧共体2.2.1.6）在交界处发生的亮氨酸合成丙酮酸/缬氨酸和乙偶姻合成途径。在乙偶姻合成途径导致双乙酰的形成（图2）。虽然只有在最后这个途径酶，乙偶姻脱氢酶（布塔），于2查明胃排空凝胶中，在pH5.0的酶量只有3％是在pH 7.0（表1）表明，是的2-乙酰乳酸已经定向到最亮氨酸/缬氨酸生物合成途径。虽然蛋白质组数据，在演唱会与酸和乙醇的最终产品的分析，都对支链的形成一致的氨基酸，在连续培养中这些氨基酸的浓度仅为2％，pH值5 ·更高pH值7.0比0（数据未显示）。不同于其他氨基酸在变形链球菌运输系统，支链氨基酸的吸收了很好的研究，并已被证明是由质子动力，推动它在细胞内的高支链氨基酸水平的成果（Dashper＆雷诺兹，1990）。从这些细胞氨基酸损失是由于被动流出通过细胞膜（Dashper＆雷诺兹，1990）。由于剩余的支链氨基酸浓度每外约0.3毫米的连续培养稳定状态，其细胞浓度将高达10毫米（Dashper与雷诺，1990）。因此，在pH5.0的增加，这些细胞合成氨基酸不一定会已在细胞外水平提高的反映。另外值得一提的是，密码子使用的分析表明，在24.4变形链球菌蛋白质的氨基酸％是支链氨基酸，这意味着将有一个很高的蛋白质合成这些氨基酸生物合成的要求。在其他生物合成途径的改变在个别蛋白表达水平的变化，即不完整的代谢途径，还确定了2胃排空。这些是与形成葡萄糖1磷酸利用，继从葡萄糖6磷酸由phosphoglucomutase（PgmA）转换的第一次。一个C-末端截短的这种酶的形式，检测pH值7.0只（图2，表1）。葡萄糖1磷酸，它是细胞内合成多糖初步基质，合成只在一个有限的范围内或pH值，与被限制在D= 0.1的H- 1（汉密尔顿，1984;表2）葡萄糖是一致的。葡萄糖1磷酸也是与鼠李糖合成，糖的分量变形链球菌细胞壁多糖（施莱弗尔＆Kilpper-贝尔兹，1987）进行相关的4种酶的初步基板。尽管这些酶第一，葡萄糖-1 -磷酸thymidyltransferase（RmlA），存在于pH值7.0的两个异构体，只有一个，检测pH值在5.0 2.4倍较低水平（图2，，表1）。其他3种酶并没有观察到在较低pH值差异表达（图2，表1）。第二个途径是代表只有一个蛋白：两个NAD的依赖甘油三磷酸脱氢酶（GPDA的异构体），形成了glycerolipid退化的最后一步，指挥碳进入糖酵解途径（图1）。两种异构体的含量分别下降了2.7个因素 - 和1.9，分别在pH值5.0（见表1）。第三个途径也派只有一个酶，lactoylglutathione酶（GloA）。这构成了糖酵解途径绕道，而转换成反应D-乳酸二羰基化合物丙酮。丙酮是有毒的，因为它可以与核酸和修改都和蛋白质（Thornalley，1996年）。从二羟基丙酮醛形成和甘油三磷酸，或未经丙糖磷酸异构酶催化。而对D-乳酸链球菌产生的数额不变，不论生长pH值（表2），对lactoylglutathione酶水平增加2.6倍，在pH 5.0（见表1）。这种上调的数额远远高于51倍的增加较少南报在分批培养变形链球菌生长无pH值控制（威尔金斯等人。，2002）。结束语在变形链球菌蛋白表型的变化，导致在pH5.0耐酸性，已通过使用一个标准化的，连续培养技术，使细胞蛋白质组的快照可能将在稳定状态下取得。这不同于在非管制一批文化，在整个环境的变化是持续增长和固定相的情况。连续培养，结合提高2胃排空既中档和窄范围IPG胶条，蛋白质组分析从而使我们能够衡量发生变化后，过渡到一个酸性环境中的代谢蛋白的表达，由变形链球菌。而在蛋白水平上清楚的累积变化的碳通量的影响，通过给定的代谢途径，这种变化不能孤立地看待。变构调节，也是稳定和相对活动细胞质pH值在给定一个特定酶，是通过建立一个通路（山田和卡尔松，1975a;山田，1987年）的最终代谢通量碳重要的标准。不过，这项研究突出了哪些变化，在中央代谢有关的酶的水平发生程度。在蛋白质表达水平变化的研究，同时测量了决赛，碳利用率，YGlc和YATP，产品证实以前的研究结果发现，在pH5.0链球菌容忍，增加他们的能力增长，挤出氢离子，而调节酸发酵生产的副产品，以减少生产的H+（汉密尔顿，1984年;石见等人的水平。，1992年;宫城等。，1994）。结果进一步表明，变形链球菌利用支链氨基酸的生物合成，降低减少在NAD（P）H的，否则将被转换为酸性副产品形式等值金额，并通过这样做有助于缓冲细胞质通过生产氨。对支链氨基酸生物合成的确切作用的变形链球菌耐酸性和有效性或这一假设，否则，是目前在我们的实验室进一步调查。在蛋白质表达水平变化的观察，但是，必须清楚地反映维持表型与变形链球菌在酸性环境中生存的复杂性相称。在这方面，多形式的蛋白质（尤其是亚型）仍有待澄清，性质一样，其中这样一个综合性的蛋白质水平变化的机制（s）的协调。 

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